石墨烯是纯碳原子的六元环平面结构构成的二维材料，具有比表面积大、杨氏模量和光学透过率高、导热性和导电性好等特点。石墨烯量子点(graphene quantum dots, GQDs)作为石墨烯家族的新成员，是由小的石墨烯碎片（通常为３～２０ｎｍ）组成的新型零维度碳基纳米材料，不仅具有石墨烯的特性，还具有量子点典型的量子限域效应、边缘效应和量子隧道效应。
因此，在光子学、复合材料、能源和电子学等领域中广泛应用。在生物医学领域，特别是在诊断、药物释放、近红外（NIR）光热疗法、活体生物体内外成像方面，GQDs展现出极大的应用前景。
１ GQDs在体外检测中的相关应用
1.1 以GQDs为基础的免疫学分析
免疫传感器通过结合高灵敏的传感技术与特异性免疫反应以监测抗原抗体反应，具有快速、灵敏、选择性高、操作简便等特点，在生物标志物检测等方面得到广泛应用。根据转导的类型，免疫传感器可分为电化学式免疫传感器、电流式免疫传感器、压电式免疫传感器等。经典免疫传感器是将抗体或抗原固定在大分子结构的膜或金属电极上，当被固定的抗体或抗原与相应的配体结合时则可将待测物质的浓度信号转变为相应输出信号。其中，抗原抗体固定材料的选择决定了反应过程中抗原抗体是否会脱落，是传感器成功与否的关键。
石墨烯优良的物理特性使其成为制造各种免疫传感器的优秀材料。以下笔者将分别介绍GQDs在电化学式、电流式免疫传感器这两种应用最广泛的免疫传感器中的应用。
1.1.1 电化学免疫传感器
近年来，电化学免疫传感器因为整合了免标记和抗原抗体相互作用的优势，使得检测体系中任何能潜在反映特定蛋白质或肽存在的变化都能被测定，而获得越来越多的关注。研究人员通过在含氮的石墨烯量子点（Ｎ-GQDs）负载PtPd构建了双金属纳米粒子（PtPd／Ｎ-GQDs），基于此建立了能够用于癌胚抗原（CEA）检测的超敏传感器。该传感器在检测CEA时展现出５fg/mL 到50ng/mL的动态响应范围，检测下限为2fg/mL，具有超高的检测灵敏度。
同时，BHATNAGAT等设计了一种基于GQD-GQD之间荧光共振能量转移的生物传感器以用于检测心肌肌钙蛋白I（cTnI）与传统检测方法相比，该传感器表现出更高的特异性、更低的检测下限（0.192pg/mL）以及更少的检测时间（10min）。他们在另一项研究中使用石墨烯量子点聚酰胺（GQD-PAMAM）纳米复合物修饰金丝网印刷电极的传感器中也得到了类似的结果。
1.1.2 电流式免疫传感器
与其他类型免疫传感器相比，电流式免疫传感器由于其微型性、稳定性、高成本效率和易于制造等特性收获了更广泛的关注。HUANG等研发了一种简单的基于二氧化钛－石墨烯、以及壳聚糖和金纳米粒子（AuNPs）复合膜修饰的玻碳电极的免疫传感器，用于血液样本中甲胎蛋白（AFP）定量检测，该方法通过静电吸附带负电荷的壳聚糖／二氧化钛-GQD复合膜，然后用固定的AFP抗体来检测AFP含量，应用该方法得到了一个比传统检测方法范围更广的检测范围（0.1-300.0ng/mL）。
电流式免疫传感器的研究与电化学免疫传感器有许多相似之处，通过GQDs的引入可极大改善所构建检测体系的检测效能。
1.2 以GQDs为基础的核酸检测
基于GQDs的电化学生物传感器为核酸检测提供了一个简单、准确、经济的检测平台，并且能够改善单链DNA（ssDNA）探针序列在各种电极基板上的固定作用，被广泛应用于各种核酸分析中。QIAN等利用GQDs优良的生物相容性和强大的荧光性能、DNA 碱基特异性配对特性以及GQDs与碳纳米管之间的荧光共振转移构建了一种能够实现低浓度DNA分析的方法。
HU等在黄金电极表面杂交捕获探针，利用在双链DNA结构（NH2-DNA）上组装的活性羧基群能够被DNA识别而构建了检测mi-RNA-155的电化学体系，其中GQDs被用于通过非共价组装实现过氧化物酶的固定，随着GQDs和酶催化的结合，该生物传感器可以检测1fM～100pM浓度范围的mi-RNA-155。
目前，提高DNA和RNA传感器的灵敏度和选择性是推动GQDs应用于生物医学领域的关键。
２ GQDs在体内成像中的应用
GQDs具有摩尔消光系数高、发射光谱窄、荧光稳定性强以及生物相容性高等特性。因此，在生物医学成像中也得到了广泛应用。与传统的成像材料相比，GQDs具有高度稳定性和荧光强度，成像时仅仅需要少量的GQDs即可产生可检测的光信号。因此，应用GQDs作为体内成像的造影剂，一直受到较高关注和期望。
与此同时，在深层组织成像方面，NIR发射窗因其组织吸收程度较低，在超过650nm波长范围时光散射率降低等有利条件使其在生物医学成像应用方面有巨大的优势，因此，具有NIR反射发射特性的GQDs成为更深层组织样本成像的候选对象。有报道基于GQDs的NIR分析仪可检测活体细胞中抗坏血酸（AA）含量，其中提到了GQDs具有良好的双光子荧光特性，并通过构建双光子纳米孔实现了检测活体细胞内源性抗坏血酸和生物成像。
在这个纳米系统中，GQDs NIR分析仪在活体系统中表现出较低的荧光背景，极大提高了荧光成像分辨率。由于活体细胞成像研究的快速发展，杂原子掺杂GQDs受到越来越多的关注。杂原子掺杂GQDs是调整带隙、优化GQDs电子密度和化学活动的有效方式，赋予杂原子掺杂的GQDs特殊光学效应。
KUO等合成一种氮掺杂GQDs（Ｎ-GQDs）用于光动力学抗菌剂治疗和生物成像，结果表明NIR光谱区域含氮GQDs具有优秀的内在发光特性和高光稳定性，使其在追踪细菌成像方面具有广泛的应用前景。
CHEN等则报道一种量子点修饰的石墨烯材料能够实现肿瘤成像、追踪以及药物释放的监控。
３ GQDs的疾病治疗相关应用
3.1 GQDs作为药物载体
为提高药物在水中的溶解度以及靶向能力，科学家们已经开发出了多种纳米材料。多功能GQDs在癌症治疗中发挥着重要作用，既可以用作药物载体，也可以用于可视化药物输送系统以了解细胞内的吸收情况，能够在不使用外部染料且不需要考虑GQDs固有荧光的情况下实时监测细胞内的药物输送情况。研究结果表明，合成的叶酸（FA）共轭GQDs可以用来负载宫颈癌治疗药物———阿霉素（DOX），这一纳米装配技术可以高准确性地将癌细胞从正常细胞中区分出来并有效地将药物输送到靶细胞。
GQDs稳定的固有荧光可以实时监测细胞对DOX-GQD-FA的吸收，以及随之发生的药物释放，通过受体介导的内吞作用，子宫颈癌传代细胞（HeLa细胞）迅速地被内化，整个过程中药物释放和积累时间延长。在体外毒性方面，DOX-GQD-FA 的纳米结构可以对靶向的HeLa细胞和非靶细胞产生不同的效果，从而能够显著降低对非靶向细胞的毒性。
同时，基于GQDs标记的受体介导内吞作用预示着一种更准确、更有选择性的癌症诊断方法。此外，有研究表明一种多模式工具混合纳米体系可用于癌细胞成像和癌症治疗，在光动力增强生物氧化还原疗法和光热疗法中，GQDs常被用作多功能的纳米载体来负载钆卟啉和镥卟啉两种光敏抗癌药物，以及在肿瘤治疗过程中能显示肿瘤反应的深红色荧光，同时，也能够在增强MRI中成像。GQDs可以通过其独特的两面和边缘结构来提高药物的装载能力，KHODADADEI等合成了10nm大小的含氮GQDs（Ｎ-GQDs）和10层石墨负载甲氨蝶呤（MTX）来构建出一个药物输送系统，结果显示Ｎ-GQDs作为纳米载体可以延长药物的靶细胞毒性作用，因而具有更强的抗肿瘤细胞活性。
3.2 GQDs在疾病光治疗中的应用
光疗是癌症治疗中一种比较有前景的治疗方法，与传统外科手术以及放化疗对患者机体正常组织细胞损伤不同，光疗能够显著减少肿瘤药物的全身毒性，并能提高放化疗治疗效果。光疗包括光动力疗法和光热疗法，光热疗法是利用有较高光热转换效率的材料，在其被注入体内后，能够靶向聚集在肿瘤组织部位，此时当其被特定波长的光（一般是NIR）照射后能够将光子转化为氧自由基，作用于周围肿瘤细胞并导致其消融，从而达到清除癌细胞的目的。
第１代和第２代光敏剂主要包括贵金属纳米颗粒和碳纳米管，其中无机量子点CdSe和CdTe已应用于临床，GQDs因有较大的光热转换面积、较高的靶向性以及在NIR区高效的光热转换能力而成为目前研究热点。
ISAKOVIC等通过电化学方法制备粒径3-7nm的GQDs，发现这种量子点在进入胶质瘤细胞后能够在470nm波长的光照下杀死胶质瘤细胞。
3.3 GQDs在杀菌中的应用
罗阳团队报道纳米级氧化石墨烯能够通过物理方式杀菌，为清除超级细菌，解决日益严峻的细菌耐药难题提供了新的方法，尽管石墨烯杀菌的研究十分火热，但是关于GQDs杀菌的报道并不多。胡超以GQDs和银氨溶液为原料，通过原位还原法制备了GQDs-Ag复合纳米材料，并发现GQDs-Ag能够抑制大肠杆菌的生长，阻碍禾谷镰刀菌孢子的萌发，对细菌和真菌都具有良好的抗菌性能，该复合物最低抑菌浓度在10μｇ/mL。上述实验说明GQDs具有协同杀菌效果，但是单独的GQDs杀菌的研究仍未见报道。
４ GQDs材料的毒性
GQDs纳米材料的毒性是其在生物技术应用中面临的主要挑战之一。一项关于石墨烯材料细胞毒性的研究表明，小于50nm的GQDs对细胞没有明显的毒性。尽管大多数单一剂量实验显示GQDs纳米材料没有明显的积累而是呈现出低毒性，但其体内毒性研究需要采用模拟临床药物管理的多剂量试验，以进一步研究GQDs的生物安全性。
NURUNNABI等对羟基化的GQDs进行了体外细胞毒性研究，没有发现明显的细胞毒性。PENG等发现浓度为40μｇ/mL的纳米级石墨烯氧化物不会对HeLa细胞产生严重的急性细胞毒性反应。LI等观察到，在高达100μｇ/mL的氧化石墨烯纳米颗粒剂量下培育胃癌细胞和皮肤细胞没有明显的细胞死亡。由于DNA损伤、变异和癌症之间存在密切的相关性，因此，在GQDs的细胞毒性研究中，评估其对DNA潜在损伤意义重大。
在WANG等通过对DNA损伤相关蛋白激活的流式细胞学分析，以及GQDs用于治疗时对NIH-3T3细胞的细胞吸收、细胞死亡和细胞增殖的研究，探讨了GQDs对NIH-3T3细胞的基因毒性，其中GQDs诱导的活性氧（ROS）生成则被确定为DNA损伤的潜在原因。
YUAN等研究了３个不同的官能团［NH2,COOH，CO-Ｎ(CH3)2］修饰后的GQDs的细胞分布，并与A549和C6细胞中的细胞毒性比较。结果表明，与不同的化学基团进行耦合改性后，GQDs仍然具有良好的生物相容性和较低的细胞毒性，这使得它们在生物成像和其他生物医学应用方面将更前景。
此外，MARKOVIC等分析了GQDs介导光动力细胞毒性的分子机制，结果显示体外氧化应激产生了光动力细胞毒性，并引起细胞凋亡和程序性死亡。然而在乳腺癌研究中却显示GQDs是非毒性物质，GQDs可以迅速进入细胞质并且不干扰细胞增殖。因此，GQDs的细胞毒性仍需进一步研究，通过不断探索GQDs的安全性，为其大规模临床使用奠定基础。
５ 结论与展望
随着GQDs合成方法的不断改进和革新，各种性能优良的GQDs被逐渐报道。由于尺寸和形状对GQDs的物理化学性质有巨大的影响，因此，如果基于GQDs的荧光检测方法想要逐渐取代传统的实验室检测技术，仍需实现GQDs的大规模、高效率稳定生产。
目前，尽管基于GQDs在生物医药应用的进展令人兴奋和鼓舞人心，但仍然面临着许多挑战。特别是在免疫传感器方面，基于GQDs的免疫传感仍处于起步阶段。需要更多肿瘤标志物、疾病诊断相关的免疫传感器应用的研究，更多基于GQDs的超敏免疫传感器的构建为疾病诊断和治疗提供支撑。GQDs具有不同颜色的光致发光（ＰＬ）特性，虽然对这一特性已经提出了一些可能的机制，如尺寸效应、表面修饰和其他元素掺杂，但关于GQDs的光致发光特性了解仍然很贫乏，限制了其在免疫传感方面的应用空间，庆幸的是研究人员正开发一系列新的表面修饰策略，GQDs无疑将被用于更多更有创意的生物医学应用领域。
总之，GQDs作为一种新型的纳米复合材料，其在生物医学领域的应用依赖于包括化学、物理、生物学和医学在内的多个学科之间的有效协作。本综述总结了近年来基于GQDs的纳米材料的研究进展，重点介绍了其在体外和体内的生物医学应用，以及细胞水平的GQDs的体内毒性。然而关于GQDs在生物医学中的应用仍有许多尚未解决的问题，只有不断研究GQDs的生物毒性以及排泄机制，才能促进基于GQDs的纳米材料在生物医学方面得到更广泛的应用。
文章作者：
石墨烯量子点在生物医学中的应用：进展与挑战
赵贤贤１，陈 菲２综述，罗 阳３△审校
（１．陆军军医大学第一附属医院检验科，重庆４０００３８；２．重庆医科大学第五临床学院，重庆４０２１６０；３．重庆大学生物工程学院，重庆４０００４５）
新闻来源：https://mp.weixin.qq.com/s/x7gXAn9NAu1sK2pBQFywww
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